細胞培養蛋白質濃度預測-近紅外線生物過程分析的下一個階段

實驗方法

在整個實驗過程中，這些物質的濃度會隨時間改變，以模擬不同細胞培養批次之間可能出現的變異性。實驗中透過添加營養成分或代謝廢物至樣品中，或以未經調整的原始細胞培養液進行稀釋，分別且獨立地調整各項成分的濃度。上述四種成分各自調整，使每一項成分均呈現兩至三種不同的濃度。表 1 列出了受測樣品中各種營養成分、代謝廢物及蛋白質的濃度範圍。此外，此實驗方法也能有效消除不同成分與蛋白質之間的共變異性（Covariance），使各項成分的濃度變化能夠獨立評估，避免彼此之間的相關性影響分析結果。

表 1. 各種成分的濃度範圍
本實驗所使用的溶液涵蓋超過 35 種不同的蛋白質濃度，
同時各溶液中的營養成分及代謝廢物濃度亦有所不同。

將超高純度的牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）添加至溶液中，作為細胞所合成之目標蛋白質的模擬物。基因改造細胞培養系統的設計目的，是使細胞能夠大量且幾乎專一性地生產目標蛋白質，而非其他細胞蛋白質。因此，細胞培養液中的蛋白質濃度通常可接近甚至超過 5.0 g/L，且幾乎完全由目標分子所組成。

白蛋白是模擬重組蛋白質的理想材料，因為它具有極高的純度，且含有與一般細胞培養系統所生產之目標蛋白質相似的近紅外活性基團（NIR-active groups）。在本實驗中，材料純度尤其重要，因為任何額外存在的物質也會產生近紅外訊號，進而干擾分析結果。實驗中，將白蛋白仔細秤量後添加至細胞培養液中，蛋白質濃度設定範圍為 0.16 至 5.0 g/L。總共配製了超過 35 種不同的溶液，各溶液中的營養成分、代謝廢物及蛋白質濃度均有所不同。

利用這些不同濃度的溶液，共取得 54 組光譜作為化學計量分析模型（Chemometric Method）的建立資料，另外取得 20 組光譜作為模型驗證資料。接著，使用 Antaris MX FT-NIR 製程分析儀，在 10,000 至 4,000 cm⁻¹ 的波數範圍內，對細胞培養樣品進行光譜掃描。

分析儀連接一支可調整光程長度的穿透反射式探頭（Transflectance Probe）。探頭間隙距離設定為 1.25 mm，因此總光程長度為 2.5 mm。每組光譜由 16 次掃描平均而得，光譜解析度設定為 8 cm⁻¹，增益值（Gain）設定為 0.1。每次樣品測量時間約為 15 秒，每個樣品共收集兩組光譜。圖 2 顯示探頭在插入細胞培養樣品前，以及進行光譜收集時的實際影像。

圖 2. 用於資料收集的穿透反射式探頭（Transflectance Probe）。
左圖顯示探頭的設計結構及可調式光程長度；
右圖則顯示光譜資料收集過程中，探頭插入細胞培養液內的實際情形。

將樣品光譜匯入 Thermo Scientific TQ Analyst™ Pro Edition 軟體，利用偏最小平方法（Partial Least Squares, PLS）進行化學計量分析，並採用固定光程長度（Constant Pathlength）模式建立分析模型。光譜資料以一階微分（First Derivative）方式進行分析，並搭配 Norris 平滑濾波器（Norris Smoothing Filter）進行處理。

本次分析選用兩個光譜區域：8,910 至 5,340 cm⁻¹。4,830 至 4,340 cm⁻¹。這兩個區域涵蓋了廣泛的光譜資料點，同時避開中心波數約 5,100 cm⁻¹、會造成訊號完全衰減的水分吸收峰，以避免水分訊號對分析結果造成干擾。圖 3 顯示樣品具有代表性的原始光譜（Raw Spectra）及其一次微分光譜（First Derivative Spectra）。

圖 3. 具代表性的原始光譜，顯示不同細胞培養樣品之間的光譜變異性。
分析時選用的光譜區域避開了位於 5,100 cm⁻¹、訊號衰減嚴重的水分吸收峰。
插圖則顯示用於偏最小平方法（PLS）化學計量分析模型的一階微分光譜。