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使用Fluigent FlowEZ 的 mRNA 封裝平台
受 2019 年新冠病毒（COVID 2019）疫情的影響，mRNA 疫苗成為疫苗學領域的領跑者，2023 年諾貝爾醫學獎授予了 Katalin Karikó博士和 Drew Weissman 博士，以表彰他們在該領域的工作發展。與傳統疫苗相比，mRNA 疫苗的生產過程簡單快捷， 生產成本更低。生產過程可以精簡和自動化，這為mRNA 技術在研究和工業規模上的快速發展提供了機會。
在發表於《Microsystem & Nanoengineering》（2023, 9:97）的論文中，Hongjuan Wei等人建立了一個通用整合平台，可直接從 DNA 範本快速、依需求製備 mRNA 藥物。該平台包含一個微流體 mRNA 封裝模組，該模組採用 Fluigent 壓力驅動控製器（FlowEZ）和流量感測器（FlowUnit）
mRNA 疫苗—疫苗學的改變者
傳統疫苗由減毒病毒或病毒蛋白製成。相較之下， mRNA 疫苗僅包含細胞產生一小部分病毒所需的指令，從而教導我們的免疫系統識別它。
由於注射的 mRNA 在細胞質中被翻譯成蛋白質，因此不存在任何基因插入的風險，這些類型的疫苗已被證明具有持久有效和安全的免疫反應 。
此外，與傳統疫苗相比，mRNA 疫苗的一個關鍵優勢是其製造簡單、快速，特別是因為它們可以在實驗室中生產而不需要任何細胞培養。
圖 1：mRA 疫苗注射後在體內的作用機轉 。
微流體技術如何幫助開發 mRNA 疫苗？
在保護我們免受疾病侵害之前， 必須保護 mRNA 免受血液中化學物質和疫苗注射過程中酶降解的破壞 。為瞭解決這個問題， 脂質奈米顆粒 (LNP) 被用作 mRNA 封裝的屏障。這種方法確保 mRNA 透過血液循環到達目標細胞類型。然而，這個過程需要脂質奈米載體的均勻尺寸和分佈 ，這是決定臨床成功的關鍵參數。
傳統方法通常需要將脂質溶液緩慢注入水相中， 無法控制脂質奈米載體的包封效率和尺寸。相較之下， 微流體技術則提供了控制這些參數的機會 ，且具有高重複性、易於自動化和簡化的流程。
有鑑於此，Hongjuan Wei等人開發了一個自動化的「按需」mRNA 製備平台 ，該平台包含一個專用模組，用於透過微流體技術將 mRNA 封裝在脂質奈米顆粒中 。此通用平台可望成為快速生成 mRNA 治療藥物的有力工具，從而加速早期研發階段的進展。
圖 2：平台中所採用的 mRNA 生產流程示意圖
該平台包含三個主要組件 ：用於擴增目標 DNA 範本的聚合酶鍊式反應（PCR）模組 、用於提供體外轉錄混合平台的加熱-磁鐵分離-混合模組 ，以及用於將 mRNA 直接封裝於 LNPs 中的封裝模組 。此平台的性能以增強型綠色螢光蛋白 （eGFP）為起始點進行評估。
在此，我們將重點介紹透過已商品化的模組將 mRNA 封裝在脂質奈米粒子中的過程和結果。
用於 mRNA LNP 的微流體封裝模組
圖 3：mRNA 封裝模組
本研究採用的微流體封裝技術基於交錯人字形微混合晶片 、Fluigent 的壓力驅動控製器（ FlowEZ） 和流量感測器（ FlowUnit） 。透過對兩個獨立的微流體儲液器（分別包含乙醇中的脂質載體和水中的 eGFP mRNA）加壓，流體會流向微流體晶片。
安裝了兩個 FlowUnit（範圍 L：0-1000 µL/min），用於測量製程中的流量，從而調節 FlowEZ 的壓力。該晶片的設計包括一個 Y 型接頭 ，用於整合兩種流體，然後是一個蛇形通道 ，用於發生微混合 ，並透過人字形結構增強混合效果。
對所得的 mRNA-LNP 以TEM進行 觀察、 以DLS 分析，並進一步評估是否能感染 HEK-293T 細胞。
部分結果：穩定、小且單分散的 mRNA 脂質奈米載體
在 mRNA 封裝模組之前，eGFP 已成功用於開發整個平台中的一組工作流程，包括洗滌、自我檢測、PCR 擴增、體外加帽轉錄、DNA 分解、poly(A)加尾和純化。
透過 Fluigent 的壓力驅動控製器 (FlowEZ) 和流量感測器 (FlowUnit) 進行調節，乙醇中的脂質載體和水中的 mRNA 的流速分別為 300 μL/min 和 900 μL/min。
圖 4：透過 DLS 確定的 LNP 尺寸分佈
透過交錯人字形晶片誘導兩種流體混合，溶解在乙醇中的脂質載體擴散並與核酸溶液混合， 透過靜電相互作用形成 LNP 。
透過動態光散射（DLS）分析，所得 LNP 的流體動力學直徑平均為 111.1±2.08 奈米。
此外， TEM 分析揭示了 LNP 的球形形狀 ，並確認了其尺寸，這與 DLS 分析結果一致。這些結果表明，有可能形成相對較小、穩定且直徑變化較小的 LNP 。
這得益於壓力驅動控製器調節的恆定流量，與注射幫浦系統不同，該控製器具有高穩定性、即時性和可重複性的特性。
將載有 mRNA 的脂質奈米粒感染 HEK-293T 細胞，螢光顯微鏡下可見 eGFP 成功表現於細胞質中 ，陽性細胞內可見亮綠色螢光 。
圖 5：透過 TEM 觀察的 LNP 形態
這些結果表明 mRNA 封裝模組在製備 mRNA 疫苗方面具有實際應用價值。
圖 6：透過螢光顯微鏡拍攝的 293T 細胞中的 LNP 轉染
結論
本文重點介紹了中國科學院（北京）生物資訊學研究中心的Hongjuan Wei等人 ，他們成功開發了一個通用整合平台及其相應的控制系統，用於 mRNA 產品的流水線化和按需製備。 利用Fluigent的壓力驅動控製器（FlowEZ）和流量感測器（FlowUnit）， 將一個基於交錯人字形微混合晶片的 mRNA 封裝模組整合到該平台中。使用此模組製備的載有 mRNA 的LNP輸出穩定且大小分佈均勻。
同時也證明其能夠成功感染細胞。這種方法為快速開發 mRNA 產品帶來了新的機會 ，並簡化了流程，可能有助於促進 mRNA 技術的普及。例如，針對緊急疫情和個人化治療開發的 mRNA 疫苗可以在研發早期階段快速產生並測試。
