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利用亞微米紅外與拉曼光譜進行微塑膠之化學鑑定
前言
近年來，微塑膠在科學研究與政策層面上受到高度關注，並已被廣泛認定為一項重要的環境與健康議題。隨著各界對微塑膠議題重視程度提升，相關研究的學術發表數量呈現指數型成長，同時也帶動研究經費的顯著增加，以深入探討微塑膠對人體健康以及全球環境所造成的影響。
圖1. 海洋中的微塑膠
文章重點摘要
• O-PTIR技術可獨特地提供高準確度的自動化紅外量測能力，適用於粒徑範圍自亞微米至100 μm的微塑膠分析。
• O-PTIR所取得的光譜不含量測假象（artifact-free），可直接與既有的FTIR/Raman光譜資料庫進行比對搜尋。
• 搭配featurefindIR與micro-chemID，可實現自動化量測與化學成分鑑別（ChemID）。
• O-PTIR 克服了拉曼光譜在微塑膠分析上的多項限制，同時仍可提供互補且具確認性的分析結果。
• O-PTIR 與拉曼光譜可同步取得同一顆微塑膠顆粒的光譜資訊，提升鑑定的可靠度。
• 共定位的螢光顯微鏡與 O-PTIR 技術結合，可快速且準確地定位並鑑別真正的聚合物顆粒，有效提升樣品分析通量。
圖2. 每年度微塑膠文獻發表數量
核心法規上線 微塑膠危害不容小覷
研究顯示，在所有微塑膠粒徑範圍中，最可能對生物造成危害的尺寸小於 20 μm，因此該粒徑區間被視為關鍵的分析門檻。
基於上述疑慮，美國聯邦與各州政府已陸續推動相關法規與管制措施，例如加州參議院法案 SB 1422（2018），明確要求對飲用水水源中的微塑膠進行分析。此外，歐盟最新的《飲用水指令》亦已納入微塑膠監測的相關規範。預期未來數年內，類似的法規要求將逐步在全球各國推行，進一步帶動微塑膠檢測需求的快速成長。
針對微塑膠顆粒進行化學成分與形貌分析，主要有三項核心驅動因素：
第一，透過了解微塑膠的來源，作為制定減少其釋放策略的依據。
第二，評估微塑膠對環境與人體健康所可能造成的潛在風險。
第三，尋找可行的方法，將微塑膠顆粒自環境中有效移除。
近期多項研究指出，當考量微塑膠的尺寸時，較小粒徑（<20 μm）的微塑膠具有最高的生物危害潛力，因此能否有效分析此一粒徑範圍，成為微塑膠檢測技術上的重要指標。
目前已有多種分析技術被應用於微塑膠不同特性的鑑別。其中，最常用的化學分析方法為傳統傅立葉轉換紅外光譜（FT-IR）與拉曼(Raman)光譜。然而，這些技術在空間解析度、量測準確性、分析通量、非接觸量測、螢光干擾等方面仍存在多項限制，使其在 <20 μm微塑膠顆粒分析上的應用受到明顯侷限。
光熱誘導效應紅外光譜（Optical Photothermal Infrared, O-PTIR）為一項新興但快速成長的超解析紅外分析技術，可提供紅外光譜的化學資訊，同時具備 <1 μm 的空間解析度，相較於傳統FT-IR顯微光譜提升約10–30 倍，且不會因顆粒形貌（尺寸與形狀）產生光譜假象。此外，O-PTIR 亦可避免拉曼光譜常見的靈敏度不足、螢光干擾與光損傷等問題，特別適合用於小尺寸微塑膠的分析。
光熱誘導效應紅外光譜(O-PTIR) 突破紅外光衍射極限
O-PTIR 技術突破了傳統紅外顯微量測的衍射極限。其原理是利用中紅外脈衝可調諧雷射照射樣品，並以第二道可見光探測雷射（532 nm）偵測紅外吸收訊號。當中紅外雷射調諧至能激發樣品分子振動的波長時，樣品會吸收能量，產生光熱效應，例如樣品表面微膨脹及折射率變化。
可見光探測雷射聚焦至約 0.5 μm 的光斑，透過散射光中產生的調變訊號來偵測光熱響應，如圖3所示。中紅外雷射可在兩秒內快速掃描所需的波數範圍，即可獲得完整的紅外光譜。
圖3. 一束脈衝可調諧紅外光源聚焦於樣品上。
當樣品吸收紅外光時，會產生加熱效應，進而產生光熱響應。
可見光探測雷射聚焦於紅外照射區域中心，
透過樣品對紅外吸收所引起的光熱效應來進行偵測。
O-PTIR與FT-IR光譜在塑膠分析上的比較
為了瞭解O-PTIR與傳統FT-IR光譜的對應關係，Böke等人進行了一項針對多種類塑膠的系統性評估。研究結果顯示，O-PTIR所取得的光譜與FT-IR光譜高度一致，如圖4所示。完整的比較細節可參考原文發表。
圖4. 不同塑膠的正規化紅外光譜（1800–800 cm⁻¹）：
（a）聚乙烯（PE）、（b）聚丙烯（PP）、（c）聚氯乙烯（PVC）、（d）聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）、（e）聚碳酸酯（PC）、（f）聚苯乙烯（PS）、（g）矽膠（Silicone）、（h）聚乳酸（PLA）及（i）聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）。
藍線表示FT-IR系統取得的光譜，紅線表示O-PTIR技術取得的光譜。
亞微米塑膠的O-PTIR光譜分析
為展示 O-PTIR 技術對亞微米級塑膠的量測能力，研究使用mIRage系統對不同尺寸的塑膠微球進行分析。圖5顯示了聚苯乙烯（PS）塑膠微球的光學影像及對應的紅外光譜，粒徑範圍從500 nm到超過4 μm。
圖5. 不論是單顆500 nm 微球或2 μm微球叢集，
所得紅外光譜皆高度一致。光譜為原始數據，未經平滑處理。
亞微米紅外光譜 樣品形狀及尺寸皆不影響的光譜結果
為展示O-PTIR技術在不同顆粒形狀與尺寸下仍可獲得無假象光譜的能力，我們建立了一個混合模型樣品，包含聚苯乙烯（PS）微球（900 nm、2 μm、4.5 μm 及 10 μm）以及聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微球。若使用傳統 FT-IR/QCL 系統，不僅部分顆粒尺寸太小而無法量測，且不同尺寸顆粒混合並靠近鹽晶體時，會產生散射假象（dispersive scatter artifacts），顯著影響光譜，進而增加準確鑑別的困難度。
為進一步展示 O-PTIR 對散射假象的抗干擾能力，這些混合聚合物微球樣品被懸浮於鹽水中，並沉積於 CaF2基板 上，使聚合物微球與鹽晶體混合分布，如圖 6 所示。如圖6所示，即使光譜來自不同尺寸的微球，各聚合物的光譜仍高度一致，沒有任何散射假象影響。這表示 無論顆粒形狀或尺寸如何，仍可正確鑑定其聚合物類型。
圖6. 左方：PS與PMMA微球光譜，粒徑範圍從0.9 μm至10 μm。
中間：對應的光學影像。
右方：在 1492 cm⁻¹ 與 1730 cm⁻¹ 收集的化學影像疊加，清楚顯示兩種材料分布。
箭頭顏色對應光譜顏色。鹽晶體以紅色圓圈標示。
注意，在紅外影像中，鹽晶體未產生任何O-PTIR訊號。
O-PTIR 指定波數化學成像功能
單波數化學成像在加快顆粒鑑定流程上非常有優勢，特別是當已知某些關鍵吸收光譜特徵，且與其他成分明顯不同時。在圖6的範例中，我們使用了PS的主要吸收峰（1492 cm⁻¹）與PMMA的主要吸收峰（1730 cm⁻¹）進行化學掃描。
O-PTIR 的一個重要特點是，光譜響應僅來自樣品吸收，其他散射顆粒不會干擾影像。這在圖6中表現得非常明顯：鹽晶體位置以紅圈標示，雖然在光學影像中清楚可見，甚至可能與聚合物微球混淆，但在單波數化學成像中，僅聚合物微球被高亮顯示，鹽晶體完全沒有訊號。
這與傳統 FT-IR 或直接QCL顯微光譜方法形成鮮明對比，傳統方法中，鹽晶體的存在會嚴重扭曲化學影像，並在附近顆粒的光譜中產生散射假象。
大尺寸與彩色微塑膠的真實紅外光譜量測
圖7顯示了 O-PTIR對不同尺寸與顏色的大尺寸微塑膠的量測結果，更加突顯出O-PTIR可分析從亞微米至約1 mm的微塑膠顆粒。
即使顆粒接近1 mm，所得光譜仍無任何假象且無吸收峰飽和效應，這對於傳統的FT-IR技術來說，在大顆粒量測時會容易出現的問題。
圖7.左上方：光學影像顯示微塑膠的位置及顏色。
右上方：表格列出微塑膠的種類。
下方：光譜顯示對大尺寸微塑膠樣品的無假象量測結果。
微塑膠光譜的同步IR與Raman分析及雙重光譜資料庫比對
除了O-PTIR的紅外量測之外，可見光探測雷射在照射區域同時會產生拉曼散射光，並可收集此訊號，實現在同一位置、同一時間、同亞微米空間解析度下，同步取得紅外與拉曼光譜。其光路示意圖如圖8所示。
圖8. 同步紅外與拉曼光譜產生的光路示意圖。
將O-PTIR與拉曼光譜整合於單一系統後，共定位且同步的紅外與拉曼光譜分析可提供強大的微塑膠量測能力，不僅可提供互補且確認性的光譜資訊，提高鑑定準確度，同時也能大幅提升量測效率。
這種強大的結合與關聯分析方法可透過二維光譜分析來展示，其中紅外與拉曼光譜的匹配品質（Hit Quality Index, HQI）同時呈現在二維散點圖中，如圖9（右上與右下）所示。我們觀察到兩顆粒徑小於 20 μm 的顆粒（粒子 1 與 2），分布在0.8 μm–20 μm篩分濾膜表面。
同步取得的O-PTIR與拉曼光譜，利用Wiley KnowItAll軟體的雙重IR/Raman資料庫搜尋功能進行比對。搜尋結果以散點圖呈現，最可能的匹配結果位於圖的右上角，該位置代表紅外與拉曼光譜的最高綜合HQI。資料庫搜尋可篩選出多種可能的鑑定結果，特別是拉曼HQI可用於排除許多相似材料，大幅提升搜尋結果的可信度。
圖9. 左上：顆粒 1 光學影像（40x Cassegrain 物鏡）
左下：顆粒 2 光學影像（40x Cassegrain 物鏡）
右上：顆粒 1 O-PTIR/拉曼光譜的 Wiley KnowItAll 雙光譜資料庫搜尋結果
右下：顆粒 2 O-PTIR/拉曼光譜的 Wiley KnowItAll 雙光譜資料庫搜尋結果
微塑膠定位與螢光顯微鏡
過去常使用Nile Red染色結合螢光技術來定位樣品中的聚合物顆粒並計數，但其無法鑑定聚合物的種類。Nile Red為親脂性染料，會優先與大部分聚合物中的碳氫鏈（CH chains）作用，使微塑膠位置可透過螢光影像被辨識。透過僅定位聚合物顆粒，而忽略其他不相關顆粒（如沙粒、生物顆粒等），可提升分析通量，避免系統在非聚合物樣品上浪費時間，也降低對樣品前處理與清理的高要求。
然而，Nile Red染色無法提供顆粒的化學鑑定，因此仍需進一步的化學分析以確認材料種類。mIRage-LS系統支援共定位O-PTIR與螢光顯微鏡功能，可更有效率地進行微塑膠的化學鑑定。
mIRage-LS操作原理：共定位O-PTIR與螢光顯微鏡
圖10顯示了mIRage-LS系統的配置，結合了亞微米O-PTIR紅外顯微鏡與共定位螢光顯微鏡。系統可在反射模式及全新高解析度對向模式（Counter-propagating mode）下運作。在對向模式中，脈衝紅外光束從樣品下方照射；螢光及可見光探測光路則透過同一顯微鏡物鏡共軸共定位。
圖10. O-PTIR與共定位螢光顯微鏡光路示意圖。
mIRage-LS操作原理：共定位O-PTIR與螢光顯微鏡
利用mIRage-LS的共定位O-PTIR與螢光功能，系統可先取得螢光影像，然後對 Nile Red染色影像中識別出的顆粒收集O-PTIR光譜。由於螢光影像與O-PTIR 光譜皆使用相同物鏡，因此不存在樣品或影像對位問題。
圖11顯示使用濾光片組取得的螢光影像，激發波長497 nm、發射波長535 nm，標示多顆聚合物微粒（紅圈）。同時也可觀察到濾膜表面有數顆不發螢光的顆粒（綠圈）。Nile Red染色能將微塑膠與非微塑膠材料區隔，避免對非微塑膠進行量測與可能的誤鑑定，進而縮短分析時間並提升鑑定準確度。
圖11. 左側：兩個螢光影像區域（Nile Red 染色），使用 GFP 濾光片組取得，激發波長 497 nm，發射波長 535 nm。
右側：Wiley KnowItAll 資料庫搜尋結果，對影像中識別的每顆微塑膠顆粒進行鑑定。
雖然拉曼光譜可同步取得，但由於Nile Red染色產生的強烈螢光背景，對拉曼量測幫助有限。幸運的是，O-PTIR光譜不受螢光影響。此外，由於Nile Red染料濃度通常很低，其存在不會改變O-PTIR光譜。
圖11（右側，上、中、下）展示了對螢光影像中標示顆粒所收集的O-PTIR光譜，使用Wiley KnowItAll資料庫進行搜尋的結果。搜尋結果顯示，這些顆粒中共識別出三種不同微塑膠：聚苯乙烯（PS）、聚乙烯（PE）以及聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）。
結論
O-PTIR光譜在各種微塑膠類型上，與FT-IR參考光譜具有極佳的一致性。mIRage與mIRage-LS顯微鏡已展示出可分析並鑑定各種微塑膠尺寸的能力，範圍從大於500 μm到亞微米級微塑膠，包括500 nm PS微球、水樣中的小於10 μm微塑膠，以及混合模型樣品中與鹽晶體共存的不同聚合物種類與尺寸的微塑膠，且在量測過程中未受到樣品尺寸或尺寸依賴散射（Mie 散射）造成的光譜假象影響。
•O-PTIR 可量測 >500 μm 微塑膠，無吸收峰飽和。
•同步 O-PTIR 與拉曼提高效率、準確度，並可確認微塑膠種類。
•光譜可匯入 KnowItAll資料庫，了解最小微塑膠組成。
•共定位 O-PTIR+螢光影像（Nile Red）可區隔微塑膠與非塑膠材料。
•支援 100 μm 至亞微米微塑膠，可靠且可整合多模態技術。
•O-PTIR 為高效率、靈活且精準的微塑膠分析技術。
文章來源：
https://www.photothermal.com/wp-content/uploads/2025/05/25_AN-107-Microplastics.pdf
