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冷凍乾燥材料關鍵參數的近紅外光譜分析
摘要
由於無法在不破壞產品的情況下開啟容器，冷凍乾燥材料對於品質保證／品質管制（QA/QC）檢測而言是一類具有挑戰性的樣品。近紅外光分析因具備穿透玻璃或塑膠等容器、直接對內部樣品進行非破壞性分析的能力，因此成為冷凍乾燥材料品質管制的理想方法。
本應用文章展示Antaris II傅立葉轉換近紅外光譜儀（FT-NIR）在分析冷凍乾燥凝血酶（thrombin）樣品時的性能。凝血酶是一種常用於醫療與牙科領域的局部止血劑。對於冷凍乾燥凝血酶而言，水分含量與效價（potency）是兩項重要的穩定性參數，而利用多變量分析技術，可從單一光譜中同時預測這兩項指標。本應用文章亦討論了冷凍乾燥餅塊（lyophilized cake）分析時需考量的其他因素。
介紹
冷凍乾燥（Lyophilization）是食品與製藥產業中常見的製程，可免除產品冷藏需求，同時大幅延長保存期限。原本在冷藏條件下僅能保存數個月的產品，經冷凍乾燥後，在某些情況下甚至可於室溫環境中穩定保存數年。
冷凍乾燥的原理是透過昇華（sublimation）去除樣品中的殘留水分。昇華是指水分直接由固態轉變為氣態，而不經過液態階段的過程，也是所有冷凍乾燥製程的核心機制。若只是單純透過加熱使水分蒸發成氣體，則樣品往往會遭到破壞。
昇華過程首先將目標化合物溶液與各種緩衝劑及成型助劑注入血清瓶中。接著將瓶塞半封閉，並將溶液冷凍至低於其玻璃轉移溫度（Tg）；若為結晶性化合物，則需冷卻至其共晶溫度以下。玻璃轉移溫度是材料進入近似固態狀態的溫度，在此溫度以下進行水分移除可獲得較高效率。隨後降低系統壓力，開始進行冷凍乾燥的第一階段為一次乾燥。
在一次乾燥階段移除大部分水分後，仍會殘留部分水分，有時仍可高達重量百分比 8%。此時進入二次乾燥階段，透過進一步降低壓力並緩慢提高溫度，逐步移除殘留水分，直到達到所需的乾燥程度。冷凍乾燥材料最根本的分析挑戰在於其封裝完成後的檢測方式。經冷凍乾燥處理的精細化學品或蛋白質具有許多重要的化學與物理特性，但若缺乏適當的分析技術，便無法確認產品是否安全且具有效性。
目前，冷凍乾燥材料通常採用批次抽樣檢測（batch sampling）的方式進行分析，即從同一批產品中抽取少量樣品，開封後再分析其水分含量、主成分（API）濃度或效價等參數。然而，批次檢測方式存在多項缺點：1.抽取的樣品未必能代表整批產品。2.樣品在分析過程中會被破壞。3.滴定法、PAGE 或 ELISA 等分析方法操作繁瑣、程序複雜且成本較高。
FT-NIR 光譜技術是一種現代化且操作簡便的分析方法，其原理是利用分子的吸收振動進行分析。FT-NIR 可穿透聚乙烯袋、玻璃瓶等包裝材料，直接獲取容器內樣品的資訊。以冷凍乾燥材料為例，低能量近紅外光可輕易穿透血清瓶（serum vial），到達待測分析物而不會對樣品造成損害。當光譜資料收集完成後，可利用多變量分析技術，從同一張光譜中同時獲取多項化學或物理參數資訊。
一般而言，FT-NIR 分析一個冷凍乾燥樣品僅需15至30 秒；相較於 Karl Fischer 水分滴定法通常需要 30 至 60 分鐘，FT-NIR在分析效率方面具有顯著優勢。
本研究說明如何利用 FT-NIR 分析冷凍乾燥蛋白質產品凝血酶（Thrombin），一種常用的局部止血劑。對凝血酶而言，兩項關鍵品質參數為水分含量（通常需低於 1.0%）及效價（Potency）。
傳統上，水分測定是利用 Karl Fischer 滴定法進行，此方法為美國藥典（USP <921>）所引用的標準技術。效價則透過樣品與血漿進行滴定後，再利用光散射測量來評估。當樣品效價較高時，凝血酶會促使血漿凝固並產生顆粒。效價越高，形成的顆粒越多，因此樣品所產生的光散射強度也越大。
上述兩種分析方法皆屬於破壞性測試，且需要由具備專業技術的人員操作。此外，分析過程耗時較長，並需使用溶劑、血漿或試劑等耗材。本研究另一部分則探討冷凍乾燥材料在光譜上的差異，包括：冷凍乾燥餅塊（cake）保持完整的樣品。
運輸過程中發生塌陷或沉降（settling）的樣品。此差異相當重要，因為即使產品仍符合使用要求，若在運輸過程中發生沉降現象，仍可能導致其光譜特徵與僅使用完整餅塊建立的校正模型產生偏差，進而影響分析結果。
實驗方法
使用兩組各 10 個凝血酶（Thrombin）樣品建立水分含量與效價的校正模型。
樣品取自最終產品批次，並利用 Antaris FT-NIR 分析儀直接穿透玻璃瓶進行量測。所有樣品均使用下圖所示的 Autosampler RS 自動進樣器附件進行分析，無需操作人員介入。
每個樣品累積掃描 32 次並進行平均，解析度設定為 4.0 cm⁻¹。每個樣品的分析時間約為 20 秒。掃描波數範圍為 4000 cm⁻¹ 至 10000 cm⁻¹。完成 FT-NIR 分析後，再以破壞性方法進行參考值測定：水分樣品使用 Karl Fischer 滴定法分析。
效價樣品使用血漿滴定光散射法分析。最後，將這些參考數據與 FT-NIR 光譜資料結合，利用 TQ Analyst™ 化學計量分析軟體建立多變量分析模型。
結果與討論
水分含量（Moisture）
將 Antaris FT-NIR 分析儀所取得的光譜資料與 10 個樣品的 Karl Fischer 滴定結果結合建立模型。樣品的水分含量約介於 0.5% 至 0.8% 之間。利用 TQ Analyst 軟體，採用 SMLR（Stepwise Multiple Linear Regression，逐步多元線性迴歸）演算法建立化學計量模型。近紅外光譜分析中通常會對光譜資料進行前處理，以提升分析模型對待測物的預測能力。
例如：
一次微分或二次微分處理。
多重散射校正（Multiplicative Scatter Correction, MSC）。
標準常態變數（Standard Normal Variate, SNV）。
平滑化（Smoothing）。
基線校正（Baseline Correction）。
本研究中由於水分在近紅外區域具有強烈吸收，因此僅採用較少的前處理。校正模型使用光譜的二次微分，並搭配 Norris 9,2 平滑濾波器建立。分析區域選擇於約 7000 cm⁻¹ 附近，也就是水的第一泛頻帶（First Overtone Band）。10 個標準樣品在該區域的光譜如圖2所示，從原始光譜即可明顯觀察到水分濃度差異。
圖2. 水的泛頻吸收帶（Water Overtone）
水分校正曲線及殘差百分比結果如圖3 與圖4所示。其相關係數（Correlation Coefficient）為 0.998，而校正均方根誤差（RMSEC）為 0.005。這兩項指標均顯示模型與資料之間具有極佳的擬合效果。交叉驗證（Cross Validation）是評估模型穩定性的重要方法。其原理為依序將每個校正樣品移除，再利用剩餘 9 個樣品建立模型並預測被移除的樣品。若模型具有良好的穩健性，則預測值應與原始值非常接近。若交叉驗證結果明顯惡化，則表示模型可能需要重新檢視或增加更多校正樣品。
圖3. 水分校正曲線（Moisture Calibration）
圖4. 水分殘差（Moisture Residual）
凝血酶水分模型的交叉驗證結果如下：相關係數（R）＝0.984。交叉驗證均方根誤差（RMSECV）＝0.018。雖然交叉驗證結果相較校正曲線略有下降，但 RMSECV 僅比 RMSEC 高數倍，顯示此模型仍具有良好的穩定性。其交叉驗證結果如圖 5 所示。由於 FT-NIR 屬於二級分析技術（Secondary Technique），因此主分析方法本身所存在的誤差會直接反映於 FT-NIR 校正模型中。若能進一步降低滴定分析的不確定度，則 FT-NIR 校正模型的表現仍有提升空間。
圖5. 水分的交叉驗證（Cross Validation of Moisture）
效價（Potency）
效價分析是將第二組10 個凝血酶樣品的參考效價數據，其來自光散射滴定測試提供，與FT-NIR光譜資料進行相關分析建立模型。這些樣品的效價範圍約介於 29,000 至 33,000。本資料集所採用的前處理方式與水分模型略有不同：演算法：PLS（Partial Least Squares，偏最小平方法）。光譜處理：二次微分。平滑濾波器：Norris 9,5。光程補償：多重散射校正（MSC）。
效價分析區域設定於 6000–6800 cm⁻¹，位於水吸收峰之間，但不包含水吸收峰本身。所得校正曲線如圖6表現極佳：相關係數（R）＝0.999。RMSEC＝21.9。
圖6. 效價校正曲線（Potency Calibration）
殘差百分比結果如圖7顯示，大部分樣品的效價預測誤差約為 ±0.09%，僅有一個樣品的殘差達-0.18%。預測誤差平方和如圖8亦呈現合理趨勢。理想的 PRESS 曲線應具備以下特徵：起始值較高。隨著因子數增加而下降至最低點。之後維持平穩或略微上升。本研究的 PRESS 圖符合上述特性。效價模型的交叉驗證結果顯示殘差增加至約 ±2.0%。然而，由於最高值與最低值樣品在校正集中的代表性不足，因此這些樣品的預測誤差相對較高。
圖7. 效價殘差（Potency Residual）
圖8. 效價的預測殘差平方和圖
利用判別分析評估冷凍乾燥餅塊沉降（Cake Settling）
冷凍乾燥材料的一項重要問題是餅塊沉降。樣品完成冷凍乾燥程序後，理論上應形成完整的冷凍乾燥餅塊。然而在包裝與運輸過程中，許多樣品可能因震動而發生沉降，使原本完整的餅塊變成粉末狀結構。
那麼，完整餅塊與沉降後的粉末狀餅塊是否能透過光譜加以區分？
利用 TQ Analyst 軟體中的判別分析（Discriminant Analysis）演算法，本研究證明這兩類樣品可以被有效區分。圖9 顯示10個凝血酶完整餅塊樣品，以及相同 10個樣品經搖晃形成粉末後的主成分分析（PCA）結果。
圖9. 沉降與完整冷凍乾燥餅塊之主成分分析圖
主成分分析是一種將光譜中的大量變異資訊（包括多個波長與吸光度變化）濃縮為較少數主成分的方法。當樣品的主成分數據繪製於二維座標圖上時，不同光譜特徵的樣品群體通常可以清楚區分。從主成分得分圖，見圖8，可明顯看出，發生沉降的餅塊可透過光譜特徵輕易辨識，並且必要時可進一步進行補償修正。
此外，使用沉降樣品建立校正模型後，其定量分析結果與使用完整餅塊建立的模型相近。下列沉降分析結果顯示，雖然完整餅塊與沉降餅塊之間確實存在光譜差異，但這些差異主要表現為散射效應的變化。若某一樣品的散射程度高於另一樣品，則兩者的基線位置會有所不同。此外，由於沉降造成堆積密度變化，也可能導致吸收強度產生差異。
在本研究中，由沉降所造成的光譜變異可透過加入少量代表此類變異的標準樣品進行補償。若原始校正模型是以完整餅塊建立，而後續又需要分析沉降樣品，則可直接將沉降樣品的標準光譜加入原有校正模型中，而無需重新建立校正模型，即可有效補償沉降效應所造成的影響。
結論
本研究證明，利用 Antaris FT-NIR 分析儀進行冷凍乾燥材料分析，是一種有效、快速且非破壞性的分析方法。在本研究中：水分含量以 Karl Fischer 滴定法作為參考方法。效價則以膠體光散射法（Colloidal Light Scattering）作為參考方法。研究結果顯示，FT-NIR 不僅能有效預測水分與效價，亦可利用主成分分析（PCA）區分完整冷凍乾燥餅塊與發生沉降的餅塊。因此，FT-NIR 提供了一種快速且可靠的品質監控工具，可應用於冷凍乾燥產品的製程控制與品質保證。
