空間解析度-FTIR顯微鏡應用的考量因素

結果

其中一項最常見的測試，是使用 USAF 1951 解析度測試靶（resolution target）。此測試靶由不同尺寸、等間距排列的線條組成，呈螺旋狀排列。每一個群組（group）包含六個物件（element），其線對解析度（line pairs）的計算方式如下：

解析度（lp/mm）＝ 2^[Group + (Element − 1) / 6]

單條線寬度（μm）＝ [1 / (2 × 線對解析度（lp/mm）)] × 1000

雖然這是一種廣泛使用的測試樣品，但也必須注意，USAF 1951 測試靶並不能代表大多數FTIR顯微鏡的實際樣品。這些線條本身並沒有特殊的紅外光譜，只是阻擋紅外光的穿透，因此理想情況下，其變化應該是在100 %穿透率與 0 %穿透率這兩個極端值之間。

然而，當線條尺寸變得更小時，實際測量結果無法完全達到這兩個理想極限，而什麼程度的峰與谷之間的差異可以被視為具有顯著區別，也成為解析度判定的一部分。圖1顯示了USAF測試靶中第6群的物件1、3 和 6的紅外影像。這些紅外影像是根據3990 cm⁻¹的吸收度所得到。在每張影像下方，則繪製了沿著垂直線穿過各組線條中央位置所測得的穿透率百分比。可以清楚解析出即使在線寬小於5 μm的情況下，仍然可以分辨出3條線。然而，對於線寬4.38 μm的線條而言，定義峰與谷的數值範圍明顯變小，而且這些線條的實際形狀也無法被清楚地呈現。這個例子說明，即使線寬只有 4.38 μm，仍然有可能「解析」出個別線條；但是，影像並不一定能真實呈現這些線條實際的尺寸與形狀。

圖1. USAF 1951解析度測試靶第6群（Group 6）中的（A）物件6（線寬 4.38 μm）、（B）物件3（線寬 6.20 μm）以及（C）物件1（線寬 7.81 μm）的紅外影像。紅外影像是根據3990 cm⁻¹的吸光度所取得。使用5 μm × 5 μm 孔徑（aperture），步進距離為1 μm。

另一種評估空間解析度的方法是進行刀口測試（knife edge test）。在此實驗中，從 100 %穿透率到0 %穿透率的區域收集光譜，並觀察從完全穿透到完全阻擋之間的轉變，以評估其轉變寬度（transition width），也就是空間解析度。此類實驗的結果如圖2所示。圖中將穿透率百分比繪製為掃描位置的函數。

圖2. 使用USAF 1951解析度測試靶進行刀口測試（knife edge measurement）。使用5 μm × 5 μm光圈，步進距離為1 μm。圖中繪製穿透率百分比（percent transmission）與掃描步距（map steps，單位：μm）的關係。紅色線分別代表90%與10%穿透率，綠色線則分別代表20%與80%穿透率。

可以看到，其轉變相當陡峭，而轉變寬度會高度依賴所選擇的判定範圍。當以 10% 與 90% 穿透率作為判定範圍時，轉變寬度為 10 μm；而當使用20 %與 80 %穿透率時，轉變寬度則降至6 μm。因此，測試判定範圍的定義方式會影響最終的測試結果。雖然這些測試可以提供一些對預期空間解析度的概念，但它們並不能真正代表實際樣品。為了進一步說明空間解析度，我們另外分析了兩種樣品。

第一種樣品是將小型聚苯乙烯球（直徑約 10 μm）嵌入環氧樹脂中，然後使用切片機進行橫截面切割。這代表在聚合物薄膜中可能遇到的缺陷或污染物。第二個範例是一種多層聚合物複合材料，分析重點是觀察該樣品中的一層薄層。這些樣品也使用拉曼顯微鏡進行分析，作為對結果的第二種驗證方式。

圖3顯示聚苯乙烯球橫截面所取得的可見光影像及FTIR峰面積影像。FTIR面積影像是根據聚苯乙烯特徵峰的峰面積（3013–3034 cm⁻¹）所建立（見圖4）。環氧樹脂與聚苯乙烯的紅外光譜非常相似，這也說明了高品質光譜對 FTIR 成像的重要性。具備寬廣的光譜範圍以及高品質的數據，對於找出光譜中可用來產生具有意義之紅外影像的重要差異非常重要。

圖3. 使用15X紅外物鏡取得的、嵌入環氧樹脂中直徑約10 μm聚苯乙烯球橫截面的可見光影像與紅外影像。紅外峰面積影像是根據聚苯乙烯特徵峰 3013–3034 cm⁻¹ 的峰面積所建立。使用5 μm × 5 μm光圈，掃描步距為 1 μm。

圖4. 樣品中聚苯乙烯（紅色）與環氧樹脂（藍色）區域的代表性紅外光譜。插圖顯示用於產生圖3紅外影像的峰面積範圍（3013–3034 cm⁻¹）。

雖然可以直接從影像中量測球體橫截面的約略直徑（10 μm），但將峰面積數值（以最大值的百分比表示）繪製成沿著穿過球體橫截面的直線之位置函數，也相當具有參考價值（圖 5）。其半高寬（FWHH）約為10 μm。為了進一步驗證結果，也使用100X物鏡以更高的空間解析度對相同樣品進行拉曼成像；圖 6 顯示其結果與紅外線分析結果具有非常良好的一致性。

圖5. 將聚苯乙烯球橫截面沿直徑方向的直線進行掃描，繪製峰面積（以最大值的百分比表示）與步距（μm）之間的關係圖。紅線表示半高位置（50%）。FWHH（半高寬）＝10 μm。

圖6. 嵌入環氧樹脂中的聚苯乙烯球橫截面影像。可見光影像與拉曼峰面積影像皆使用100X 物鏡取得；拉曼峰面積影像是根據聚苯乙烯特徵峰992–1011 cm⁻¹ 所建立。測量條件：532 nm雷射、10 mW、影像像素尺寸 0.5 μm、25 μm針孔（pinhole）。

FTIR 顯微鏡較常見的應用之一，是分析多層聚合物複合材料。由於其中某些層可能非常薄，因此空間解析度可能會成為一項重要的考量。為了說明這一點，本研究分析了一個相對較薄的聚氨酯（polyurethane）層，其厚度約為 6 μm，位於尼龍（nylon）與聚乙烯（polyethylene）層之間。圖7顯示此多層聚合物複合材料橫截面的可見光影像，以及分別針對聚氨酯層與其兩側相鄰層所取得的 FTIR 峰面積影像。用於產生聚氨酯紅外影像的峰面積範圍為 1302–1330 cm⁻¹，如圖8所示。

圖7. 多層聚合物複合材料橫截面的可見光影像。圖中標示的區域使用5 μm × 10 μm光圈（aperture）及1 μm掃描步距進行分析。拉曼峰面積影像（a–c）顯示聚氨酯層（b）以及其兩側相鄰的兩個層（a）尼龍與（c）聚乙烯的位置。

圖8. 三個材料層的代表性紅外光譜（紅色－聚氨酯、綠色－聚乙烯、藍色－尼龍）。插圖顯示用於產生圖7中聚氨酯紅外峰面積影像的峰面積範圍。

雖然可以直接從紅外影像中估算聚氨酯層的厚度，但另一種方法是將峰面積數值（以最大值的百分比表示）繪製成地圖位置的函數，並沿著垂直於聚合物層排列方向的直線進行分析（圖 9）。

圖9. 將峰面積（以最大值的百分比表示）繪製成步距（μm）的函數，測量方向為垂直於聚合物各層排列方向的直線。紅線表示半高位置（50%）。FWHH（半高寬）＝ 8 μm。

FWHH（半高全寬）可用來表示聚氨酯峰的寬度，其測得值約為 8 μm。這與利用拉曼影像（圖 10）所得到的 6 μm 數值相當接近。

圖10. 多層聚合物複合材料的橫截面影像。可見光影像與拉曼峰面積影像皆使用50X 物鏡取得；拉曼峰面積影像是根據聚氨酯特徵峰 1602–1626 cm⁻¹ 所建立。測量條件：532 nm 雷射、10 mW、影像像素尺寸 1 μm、25 μm 針孔（pinhole）。