首頁 技術支援 技術文章分享 應用實例-用壓力評估細胞生長
技術支援

應用實例-用壓力評估細胞生長

2021/06/28

翻譯並改寫自Fluigent Application Note

摘要

此篇應用實例將呈現一種在微流體晶片中實時監測細胞增殖的簡單方法,實驗上也展示了一個客製化的微流體晶片,在此流體與靜態的條件下研究對細胞型態的影響。

前言

與在燒瓶、培養皿與微量樣品盤中進行培養相比,微流體細胞培養具有明顯的優勢[1]。微流體晶片的製造過程使晶片設計具有極大的靈活性,允許人們控制細胞、基質和培養基之間物理和生化的相互作用[2]。這項技術提供了新的可能性,準確地複製細胞環境並進行生物學分析,而這是以前無法做到的。從形態角度來看,晶片可以在細胞尺度上被建構,從而重現細胞所經歷的機械限制。從生化角度看,穩定的梯度可以以高空間解析度(通常為微米級別)實現。最後,持續固定的灌流使營養素和氧氣不斷更新補充,從而促進細胞生長,以及在長時間細胞培養過程中保持最佳活性。因體積減少而降低了成本這也是微流體技術的主要優點,因為許多用於生物測定或細胞培養研究的試劑是非常昂貴的[2]。

圖1.微流體細胞培養的優勢與挑戰

優勢 挑戰
  √ 裝置設計的彈性   → 非標準培養步驟
  √ 即時分析   → 新穎的培養表面
  √ 持續灌流培養   → 複雜的晶片設計與操作控制
  √ 減少試劑消耗    
  √ 單細胞控制能力    
  √ 自動化培養能力    

儘管將細胞培養改以微流體方法培養有這些好處,但常常需要修改培養條件與步驟。微流體細胞培養和一般細胞培養方法相比,有一些獨特需要考量的因子,例如:不同的培養材料、氧氣、滲透壓、pH值及養分消耗。在培養從一般培養方法轉移到微流體培養前,比較細胞在兩種培養方法的行為模式是很重要的。
細胞增殖分析或活/死細胞分析在控制細胞存活率上是很常見的分析[3,4],然而進行這些分析卻是又貴又耗時。下方這兩種是最常見的分析方法:

1. 顯微鏡細胞計數:細胞被固定並用DAPI染色,然後以顯微鏡分區計數這些區域內的細胞核。這個方法主要的缺點在於它的準確性依賴於細胞種類和密度,有些細胞以三維空間增殖,相對於平面生長散佈的細胞來說,小又密集導致計數困難。
2. 計數盤細胞計數:胰蛋白酶化(trypsinization)及細胞懸浮對計數盤細胞計數是必要的,而這對貼附性細胞計數有困難。

這兩種方法都是所謂的終點分析,一次只能分析一個時間點,導致同樣的樣品不可能被重複分析。一個研究者想要隨時間監測細胞增殖,需要每一個時間點都要取樣。與終點分析不同,即時分析系統,一般是使用有能力以固定時間間隔拍攝細胞影像的設備,並定量細胞覆蓋區域,可以追蹤整個實驗隨時間細胞的生長[5]。雖然有高準確性,但這些系統通常非常昂貴、使用困難、常不適合用在微流體上。
因此我們展示了一個替代的方法,在控制微流體晶片流量下,即時監測細胞生長。這個方法是以計算流體動力阻力達成,需要使用壓力控制器並搭配流量計可控制流量。簡而言之,在微流體晶片中入口與出口的壓降與流量存在以下關係:

ΔP= Rh.Q

ΔP是管道兩端的壓差(壓降);Rh是微流體系統的流體動力阻力,可以被認知為在給定的推送壓力下對流體的阻力;Q則是流量。在固定壓降下,越高的阻力導致越低的流量。流體動力阻力與通道長度成正比,與通道內徑四次方成反比[6]。細胞生長隨時間改變了阻力,當細胞在微流體晶片內增生而密度增加,通道尺寸相當於減少了。這個阻力的改變可以使用壓力控制器連接流量計而偵測出來,如果設定固定流量,當阻力增加了,所施加的壓力勢必需要增加以保持固定的流量。因此,只要監測壓力的變化就可以獲得細胞增殖的資訊。

測量細胞增殖的方法

1.通用的系統設置及步驟

(1) 設置

圖2:系統設置。Flow EZ壓力控制器連接到樣品管,以控制不同的壓差(ΔP),管線穿過流量計以量測實際流量,然後連接於微流體晶片。

設置包含下列材料:

  A. 壓力控制器:Flow EZ壓力控制器是最先進的氣動式流體控制裝置,可以與流量計搭配進行壓力或流量回饋控制。此實驗所使用的壓力範圍為10-40 mbar。
  B. 流量計:Flow unit M 流量計允許即時監測流量,範圍可達80 μL/min (其他範圍另有其他型號可選)。與Flow EZ壓力控制器搭配,可從壓力控制轉換為流量控制。
  C. 細胞培養晶片。至少兩晶片應用來做第一次的校正。
  D. 微流體管線
  E. 細胞培養液
  F. 細胞株
(2) 即時測定微流體晶片內細胞增生的步驟 
  A. 依照圖2描述方式連接各部件。樣品管內裝要被注入晶片的細胞培養液,流量計連接於壓力控制器上,以便進行後續的流量控制。
  B. 使用適當的流速將細胞懸浮液注入微流體晶片,放置整晚或適當的時間讓細胞貼附晶片。
  C. 第一個實驗是獲得標準的<貼附細胞/注入細胞>的比例,以計算貼附細胞的數量。等待讓細胞貼附的時間後,細胞用胰蛋白酶切下來以上述計數盤計數細胞。當使用胰蛋白酶確保只計數晶片內貼附細胞時,我們建議使用新的管線。(例如:20萬細胞注入晶片中,隨後計算出有15萬細胞貼附,那麼系統標準的<貼附細胞/注入細胞>的比例就是0.75)
  D. 使用A-i-O(監控)或MAT(自動化程控)軟體,以適合細胞培養的固定流量Q注入細胞培養液3天。當細胞增殖時,晶片阻力應該會隨之增加。因為ΔP= R x Q中流量是維持固定的,所以當晶片阻力增加時,壓差ΔP也會增加。(提醒:需要上述A-i-O或MAT軟體紀錄數值)
  E. 畫出壓差ΔP隨時間變化的關係圖。
  F. 由第一個實驗所獲得初始貼附細胞的數量計算,可以獲知壓力增加與新細胞數量的關係。細胞用胰蛋白酶切下來以計數盤計數細胞,獲得最終細胞總數。
  G. 繪製壓差ΔP與細胞數量的關係圖,分別在t=0(沒有細胞注入)、細胞注射後以及注射後3天,並繪製相關線性趨勢,關係圖如圖3所示。這樣可以利用壓力預估細胞數量,例如:以圖3為例,細胞數量Ncells= (ΔP-10) / 4X10-5

圖3.保持固定流量所施加的壓力與微流體晶片內細胞數量的關係圖 

實驗可重複進行,至少三重複,以獲得具統計意義的結果。

2.展示的實例

依照上述通用的設置與步驟,固定流量設定為10μL/min。晶片與管線描述如下:

(1) 微流體細胞培養晶片:貢比涅技術大學 (University of Technology of Compiègne) 生物力學與生物工程實驗室(Biomechanics - Bioengineering (UMR CNRS 7338))所開發的一個3D微流體晶片,此晶片由生物相容性材料製作,允許持續更新補充培養液的動態條件培養細胞。
(2) 管線:外徑1/32吋、內徑254 μm及157 μm的PEEK材質管線。
(3) 細胞株:HepG2/C3A細胞株,源自人類肝腫瘤細胞ATCC-CRL-10741, USA。

為了增加細胞貼附晶片,膠原蛋白(collagen)已先塗佈於晶片上。大約25萬顆細胞注入晶片中,有大約15萬顆細胞貼附。
為了測定流速是否影響細胞增殖與型態,也做了肌動蛋白與細胞核染色實驗:晶片以PBS緩衝液潤洗後,三聚甲醛注入晶片固定細胞,然後以0.5% Triton X-100將細胞打洞。Hoechst用來染色細胞核,phalloidin用來染色F-肌動蛋白,這些染色液注入晶片後等待30min染色。再以光學顯微鏡的螢光模式觀測細胞。

結果

1.即時測量微流體晶片中細胞增殖

圖4顯示了以固定10μL/min流量注入三天的紀錄,圖5則顯示了壓差ΔP在同一時間段的變化。

圖4.流量對時間記錄圖

圖5.壓差ΔP對時間記錄圖

我們觀察到流量在三天時間內保持恆定,而所施加的壓力從初始12 mbar在三天後到達24 mbar,這個壓力增加來自於細胞增殖。

2.此實驗在5張晶片重複進行了5次,結果顯示於圖6. 

圖6.壓差ΔP對時間記錄圖

我們觀察到壓差與培養的細胞數目有好的關聯性,線性斜率及細胞數量的計算公式如下:

ΔP=5x10-5 x Ncells + 10
=> Ncells= (ΔP-10)/5x10-5

在相同的條件、相同的系統下,使用者可以使用上述的公式計算細胞培養數量,與其他實驗平行地即時監測細胞增殖狀況。

3.在連續及動態流體的狀況下細胞活性狀況

在動態流體與靜態培養狀況下細胞型態比較如圖7。圖7 顯示肌動蛋白網絡在動態流體培養下發展的比靜態培養下更好。事實上流體培養施加很小的剪切力在細胞上,而傾向拉長細胞,造成後續平面方向的細胞生長;在靜態培養下,因無剪切力施加,細胞傾向三維的生長。當細胞以三維方向生長時,會因取得營養或氧氣不平均,導致細胞型態異質性增加。有持續不斷的灌流提供一致的養分及持續施加小的剪切壓力,動態流體環境是細胞更喜歡的生長環境。

圖7.細胞型態比較

結論

我們在這裡展示了使用壓力控制器與用於即時監測細胞增殖的流量感測器及微流體晶片,使用者可以即時通過簡單地監測壓力增加來監測細胞增殖。這種方法允許人們以一種便宜時尚的方式評估晶片內的細胞增殖動力學。該系統顯示出巨大的優勢,因為它提供壓力和流量的即時資訊,而非終點分析所需在不同時間點重複實驗,因此使其成為一個強大而多功能的工具。

參考文獻

1. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R. & Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens. Bioelectron. 63, 218–23 (2015).
2. Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y. & Friend, J. R. Microfluidic devices for bioapplications. Small 7, 12–48 (2011).
3. Lee, J. N., Jiang, X., Ryan, D. & Whitesides, G. M. Compatibility of mammalian cells on surfaces of poly(dimethylsiloxane). Langmuir 20, 11684–11691 (2004).
4. Ma, T., Grayson, W. L., Fröhlich, M. & Vunjak-Novakovic, G. Hypoxia and stem cell-based engineering of mesenchymal tissues. Biotechnol. Prog. 25, 32–42 (2009).
5. Single, A., Beetham, H., Telford, B. J., Guilford, P. & Chen, A. A comparison of real-time and endpoint cell viability assays for improved synthetic lethal drug validation. J. Biomol. Screen. 20, 1286–1293 (2015).
6. Huber, D., Oskooei, A., Casadevall Solvas, X., Andrew Demello & Kaigala, G. V. Hydrodynamics in Cell Studies. Chem. Rev. 118, 2042–2079 (2018).
TOP